Диагностика бактериального вагиноза

Наиболее распространенное гинекологическое расстройство репродуктивного возраста бактериальный вагиноз (БВ), как правило, проявляется в виде аномальных выделений. БВ может способствовать преждевременным родам, инфицированию амниотической жидкости, хориоамниониту, воспалительным заболеваниям тазовых органов, цервициту и повышенной восприимчивости к различным половым инфекциям.
Не существует конкретного этиологического агента, ответственного за развитие БВ, этот синдром считается нарушением экологии вагинальной микрофлоры, и характеризуется истощением лактобактерий - доминирующей микрофлоры, со сдвигом к большему бактериальному разнообразию, с интенсивным разрастанием синантропных анаэробных бактерий в 100-1000 раз выше нормы.

Традиционный культуральный метод выявляет множество бактерий, ассоциированных с БВ, в том числе Gardnerella vaginalis, Prevotella spp., Porphyromonas spp., Bacteroides spp., Peptostreptococcus spp., Mobiluncus spp. и Mycoplasma hominis. Однако истинные масштабы микробного разнообразия открылись только при таксон-орентированной ПЦР, флуоресценции гибридизации in situ  (FISH) и 16S рДНК ПЦР с денатурирующим градиентным гель-электрофорезом (DGGE), выявивших: Atopobium vaginae, Megasphaera spp., Leptotrichia spp., Dialister spp. и три типа БВ ассоциированных бактерий - BVAB1, BVAB2, BVAB3 (п. Clostridiales).

В клинической практике диагноз БВ устанавливается по Amsel-критериям при наличии, по крайней мере, трёх признаков: гомогенные выделения при отсутствии признаков воспаления, наличие «ключевых клеток» при микроскопии мазков, рН вагинального отделяемого >4,5 и положительный аминный тест «рыбного» запаха после добавления 1% или 10% раствора КОН.

БВ также можно поставить по Nugent-критериям, оценивающим долю лактобацилл по отношению к БВ-ассоциированным бактериальным морфотипам Gardnerella/Bacteroides и Mobiluncus  в препаратах. Кроме того, используется оценка лактобациллярной степени во влажном мазке.
Описанные три метода часто используются в научных исследованиях, однако, эти методы редки в рутинной практике. Клиницисты не имеют навыков микроскопии влажных препаратов, кроме того, методы основаны на субъективной оценке, что влияет на точность диагностики.


Целью настоящего исследования было изучение состава вагинальной микрофлоры репродуктивного возраста при массовом параллельном пиросеквенировании и количественном анализе методом ПЦР в реальном времени, и разработка молекулярных критериев диагностики БВ.
Материалы и методы. В исследование включены 163 небеременные женщины репродуктивного возраста 15-54 лет, из которых 73 имели вагинальные жалобы, а 90 считались здоровыми. Исключалось применение противомикробных препаратов в течение предшествующих 4 недель, разрешались внутриматочные спирали или местные противозачаточные средства. Все женщины с БВ получали лечение.
У каждой участницы 10 мкл пластиковой петлёй брали 2 соскоба со свода влагалища. Один образец для влажного мазка, другой – для 454 пиросеквенирования гипервариабельных областей V3-V4 гена 16S рРНК и количественного определения методом ПЦР: G. vaginalis, A. vaginae, Sneathia sanguinegens, Leptotrichia amnionii, Lactobacillus iners  Eggerthella, Prevotella, BVAB1, BVAB2, BVAB3, Finegoldia magna, Megasphaera type 1, Megasphaera type 2, BVAB-TM7, Mobiluncus curtisii и M. Mulieris.
Использованы Amsel-критерии, менее трёх критериев – женщина считалась здоровой. Когда критериев Amsel было недостаточно, а во влажном мазке определялось малое количество ключевых клеток и смешанная флора из кокков и палочек, состояние расценивалось как пограничное.
Результаты и выводы. Из включенных в исследование 163 женщин, здоровой контрольной группой были 79, у 73 диагностирован БВ и у 11 - пограничное состояние. Секвенирование продемонстрировало обширные различия между группами.
У большинства здоровых женщин было абсолютное преобладание лактобактерий, и ассоциированые с БВ таксоны определялись крайне редко.
Доминирующими таксонами при пограничном состоянии были Lactobacillus и Gardnerella. У нескольких здоровых женщин было зафиксировано смещение микрофлоры в сторону пограничной.
При БВ выявилась разнородная группа с высокой долей Gardnerella, Atopobium, Eggerthella, Prevotella, BVAB1, BVAB2, Lactobacillus, Megasphaera и Sneathia/Leptotrichia. Пациенты с БВ имели примерно следующий состав: G. Vaginalis (29%), Prevotella (13%), Megasphaera type 1 (10%), A. Vaginae (7%), L. amnionii (7%), L. iners (7%), BVAB1 (6%), BVAB2 (6%), S. Sanguinegens (4%) и Eggerthella (1%).
У здоровых женщин на 90% вагинальная микрофлора состояла из Lactobacillus , приемущественно, L. Crispatus и L.iners. В пограничных случаях 75% составляли L. Iners и G. Vaginalis.
При 454 пиросеквенировании у здоровых женщин наиболее часто встречалась L. iners (86%), G. vaginalis (78%), A. Vaginae (63%), Prevotella spp. (62%) и F. magna (58%).
При пограничном состоянии наиболее распространенными видами были G. vaginalis (100%), L. iners (91%), A. vaginae (91%), Prevotella spp. (82%) and L. amnionii (82%).
У 100% больных БВ выявлялись G. vaginalis и A. vaginae. Широко распространёнными бактериями при БВ были  Prevotella spp. (96%), Megasphaera type 1 (96%), L. iners (93%), Eggerthella spp. (93%), BVAB2 (90%), L. Amnionii (88%) и S. sanguinegens (81%).
По критериям Amsel оценена чувствительность и специфичность качественного определения различных видов бактерий для диагностики БВ.
Качественное определение ПЦР было высокочувствительным для прогнозирования БВ G. Vaginalis (100%), A. vaginae (100%) и Prevotella spp. (96%), но эти бактерии обнаруживались у большинства здоровых женщин, 22%, 37% и 38%, соответственно, что приводит к низкой специфичности.
Учёт количественных характеристик резко улучшает диагностическую ценность для G. Vaginalis 88% чувствительность и 95% специфичность,  для A. vaginae 96% чувствительности и 97% специфичности. С использованием 454 пиросеквенирования, чувствительность и специфичность обнаружения БВ составила 96% и 78% G. vaginalis и для A. vaginae 96% и 97%.
В противоположность этому  высоко специфичны для БВ Megasphaera 2 типа (99%), BVAB3 (97%), BVAB-TM7 (97%), М. Mulieris (95%) и М. curtisii  (92%), однако, чувствительность прогнозирования БВ была очень низкой: 10%, 27%, 23%, 12% и 43%, соответственно.
Лучшая комбинация чувствительности и специфичности отмечалась при Megasphaera тип 1 (96% и 65%), Eggerthella  (93% и 78%), BVAB2 (90%, и 78 %).

Таким образом, результаты подтверждают, что БВ связан с существенным качественным изменением вагинальной микрофлоры. БВ ассоциируется с  G. vaginalis, A. vaginae, Eggerthella, Prevotella, BVAB2 and Megasphaera и анализ их относительного или абсолютного содержания является хорошим маркёром БВ. Наилучшая диагностическая ценность доказана для A. vaginae.