Иммобилизованные протеазы для очищения раневых поверхностей

Владислав Владиславович Верниковский, канд. биол. наук, преподаватель кафедры технологии лекарств Пятигорской государственной фармацевтической академии.

Элеонора Фёдоровна Степанова, д-р фармац. наук, профессор кафедры технологии лекарств Пятигорской государственной фармацевтической академии, профессор.

 

Одним из серьезных вопросов современной хирургии является лечение ран с большим содержанием некротических тканей, которые плохо удаляются в процессе традиционной обработки. Раневой процесс представляет собой сложный комплекс физиологических реакций, развивающихся в организме при повреждении тканей [1].

«Золотым стандартом» очищения гнойных ран до сих пор считается хирургическая обработка, осуществляемая при помощи скальпеля. Однако существует ряд ситуаций, когда использование этого способа невозможно. Например, важнейшими условиями его успешного применения являются наличие адекватного количества жизнеспособных тканей вокруг раны, а также отсутствие тяжелой ишемии в районе механического воздействия. В случае легких поражений использование скальпеля для очистки раны также необоснованно [2]. Сложной и нерешенной проблемой хирургии является лечение ран с большим содержанием некротических тканей, которые невозможно полностью удалить во время хирургической обработки. Для этой цели используют различные средства, но главным образом – протеазы, что считается наиболее перспективным и биологически мягким способом [3]. Многочисленными работами отечественных и зарубежных ученых было доказано, что раневой процесс является процессом ферментативным [4], поэтому применение для лечения ран энзимсодержащих препаратов патогенетически оправдано [5].

 

Несмотря на то, что протеазы используются в терапии раневого процесса уже достаточно длительное время, в Федеральном руководстве по использованию лекарственных средств за 2010 г. упоминается только 3 соответствующих лекарственных препарата (трипсин кристаллический, химотрипсин, химопсин), причем использовать их предполагается исключительно при гнойно-воспалительных процессах челюстно-лицевой области; в данном руководстве отсутствуют указания к выбору препаратов для терапии ран и ожогов поверхностей тела. При этом ферментные препараты отнесены к подгруппе «Противовоспалительные средства других групп». Следует также отметить, что использовавшаяся ранее мазь «Ируксол» исключена из данного перечня [6]. Л.В. Деримедведь и соавт. приводят 10 лекарственных препаратов, предлагаемых к применению в I фазу раневого процесса, и только один из них содержит протеолитический фермент и, соответственно, обладает некролитическим действием [7]. 

 

Что касается зарубежных источников, то в «Encyclopedia of Chemical Technology» раноочищающие препараты с протеолитическими ферментами выделяются в отдельную подгруппу «Topical Enzymes» (ферменты для местного применения), предназначение которых заключается в избирательном удалении некротизированных тканей из ран и ожогов. В эту подгруппу включены такие лекарственные препараты как «Travase» (Boots), «Santyl» (Knoll AG; содержит коллагеназу), «Elase» (Fugisawa), «Granulex» (Hickam; содержит трипсин и папаин), «Panifil» и «Panifil White» (Rystan; содержат папаин и мочевину) [8].

Справочник лекарственных средств М.Д. Машковского также значительно расширяет номенклатуру препаратов протеолитических ферментов, предлагаемых для очищения раневых поверхностей. Так, в группу IV «Ферментные препараты и ингибиторы ферментов» входит подгруппа «Ферментные препараты, применяемые преимущественно при гнойно-некротических процессах», в которую включено 13 ферментных препаратов. Из них 11 – препараты протеолитических ферментов, из которых только 3 препарата содержат протеазы в иммобилизованном состоянии. Остальные лекарственные препараты протеолитических ферментов представляют собой нативные протеазы (трипсин, химотрипсин, террилитин и др.), наносимые на некротизированные ткани в виде присыпок или водных растворов, приготавливаемых ex tempore, которыми смачивают текстильные подложки [9].

 

Протеазы, оказывая протеолитическое действие, способствуют очищению ран, а также оказывают противовоспалительное, фибринолитическое и противоотечное действие [9, 10, 11]. Однако непосредственное введение нативных протеаз в рану приводит к их быстрой инактивации, что делает энзимотерапию малоэффективной. Так, согласно сведениям И.М. Перцева с соавт., некролитическое действие протеолитических ферментов при непосредственном внесении в рану длится всего 15-30 минут [12]. В связи с этим в настоящее время все чаще применяют препараты иммобилизованных протеаз, в которых ферменты находятся в связанном виде. Иммобилизация позволяет локализовать действие протеаз в требуемой области, а также способствует повышению их термостабильности и устойчивости в условиях раны [13, 14].

Проведенный анализ литературы позволил объединить доступные нам сведения о препаратах иммобилизованных протеолитических ферментов. При анализе интерес представляли источники получения протеаз, лекарственные формы и методы иммобилизации ферментов, используемые в них, а также случаи комбинирования протеаз с лекарственными веществами других фармакологических групп, в частности – с антибактериальными веществами.

 

Среди раноочищающих препаратов, описанных в доступных нам источниках, были выделены следующие группы по лекарственным формам: 1) суспензии и эмульсии; 2) порошки; 3) пленки и мембраны; 4) гелевые повязки; 5) волокнистые материалы; 6) мази и гели. Следует отметить, что некоторые работы не содержали указания на вид получаемой в результате иммобилизации лекарственной формы, а в других на базе одного или нескольких ферментов разрабатывалось сразу несколько лекарственных форм.

 

Наиболее редко встречающимися лекарственными формами протеаз являются суспензии и эмульсии. В доступной литературе были обнаружены сведения лишь об одной эмульсии [15] и двух суспензиях [9, 16, 17, 18] протеолитических ферментов. Однако, несмотря на то, что согласно дисперсологической классификации лекарственных форм суспензии и эмульсии относятся к одной подгруппе «свободные всесторонне дисперсные системы с жидкой дисперсионной средой» (и по этому признаку были нами объединены), следует учитывать, что принципы конструирования и используемые в этих формах методы иммобилизации протеаз были различны. Так, в случае создания эмульсии протеолитический фермент в растворенном состоянии диспергируется в жидкой среде, то есть в данном случае используется метод включения, а в качестве матрицы-носителя можно рассматривать дисперсионную среду. В случае же суспензий использовалась более сложная схема. Дисперсионной средой в обоих известных случаях (суспензии профезима 10% и процелана 20%) выступал изотонический раствор натрия хлорида. Фермент (протосубтилин) предварительно иммобилизовался при помощи химических связей на аминоэтилцеллюлозе [19], а уже полученный порошок суспендировался. Таким образом, можно говорить, что в случае суспензий используется «двойная» иммобилизация: фермент иммобилизуется на носителе, который, в свою очередь, вносится в дисперсионную среду.

 

Несколько более часто в качестве лекарственной формы для иммобилизованных протеаз использовались порошки. В эту группу попало 5 лекарственных препаратов, различающихся используемыми носителями, методами иммобилизации и способами применения. Лекарственный препарат «Терридеказа» представляет собой протеолитический фермент террилитин, являющийся продуктом жизнедеятельности плесневого гриба Aspergillus terricola, ковалентно связанный с окисленным производным декстранполиглюкина [9, 17]. Перед применением порошок требуется развести и наносить на обрабатываемую поверхность в виде раствора. Остальные порошкованные иммобилизованные препараты применяются в виде присыпок. Характерной особенностью является использование в этом случае в качестве носителей набухающих полимеров полисахаридной природы: альгината натрия в присыпке «Сипралин», содержащей протеазу С [20], и декстранов различных марок в порошках, содержащих папаин, трипсин и химотрипсин [21].

Несмотря на указанные сходства, при получении присыпок использовались различные методы иммобилизации. Иммобилизация протеазы С на альгинате натрия обеспечивалась адсорбцией за счет так называемых «слабых» связей (водородных, координационных и др.), возникающих за счет взаимодействия карбоксильных групп альгиновой кислоты и аминных и других положительно заряженных группировок на поверхности фермента. Связывание протеаз с декстранами, напротив, осуществлялось методом ковалентного связывания после обработки носителей активирующими агентами: бромцианом, раствором 4-нитрофенилглицидилового эфира и натрия гидразида в толуоле, 2-амино-4,6-дихлоро-S-триазином. Образующиеся при этом химические связи прочно закрепляют молекулы фермента на носителе и препятствуют его десорбции в процессе применения.

 

Пленки и мембраны предназначены для аппликации на раневую или ожоговую поверхность, что диктует необходимость наличия у используемых матриц адгезивных свойств. Составы матриц отличаются весьма значительно: от одного полимера-носителя (например, поливинилбутириловая мембрана [22]) до сложных композиций, состоящих из нескольких компонентов (например, композиция, образованная ПЭО 400, сополимером поливинилпирролидона и поливинилового спирта, гидроксипропилцеллюлозой и декстраном-40 [23]). 

 

Широко используются сополимеры и модифицированные полимеры. Следует отметить, что при изготовлении пленок и мембран для иммобилизации протеаз в основном используются методы включения (протеаза включается в структуру при формовании пленки или мембраны) и ковалентного связывания. При использовании ковалентного связывания возможны два варианта: либо подложка предварительно активируется специальными реагентами с последующей обработкой раствором фермента, либо матрица выдерживается в растворе протеазы, а затем поверхность с адсорбировавшимся ферментом обрабатывается сшивающим реагентом. Чаще всего это глутаровый альдегид, но могут быть использованы и другие вещества, например, 1,1-карбонилдиимидазол, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-мето-4-толуолсульфонат [17, 22]. При обработке сшивающими реагентами после адсорбции на поверхности носителя возможно образование химических связей не только типа «фермент-носитель», но и «фермент-фермент». Однако возможны случаи, при которых предварительной модификации подвергается не носитель, а сам фермент. Так, в работе Н.Р. Кильдеевой и соавт. химотрипсин связывался с карбоксиметиловыми эфирами декстрана, содержащими остатки 2-амино-4-хлор-S-триазина, для повышения стабильности и снижения возможной десорбции из матрицы – пленки триацетата целлюлозы [24]. 

 

Сложным составом обладают плёнки с гидролитином, матрица которых состоит из подложки из полиэфирных смол и сополимеров винилхлорида сшитой с гелем поливинилпирролидона и его сополимеров с акриловыми мономерами [25]. Интересен способ иммобилизации, использованный при создании этой лекарственной формы, состоящий из двух стадий. В первую стадию поверхность подложки активируется химическими методами, а во вторую происходит сополимеризация активированной поверхности подложки с гелем производных поливинилпирролидона, содержащим фермент. 

 

Таким образом, фермент оказывается пространственно ограничен каркасом из молекул полимера, сшитых с подложкой. Следует отметить, что данный способ иммобилизации оригинален и не был встречен более в других проанализированных работах по иммобилизации протеаз. Из группы пленок выделяется также лекарственный препарат «Продиоксилонг», содержащий протосубтилин. Главной особенностью этого лекарственного препарата является использование в качестве матрицы для иммобилизации биорастворимой композиции из масла какао и сополимера акриламида, N-винилпирролидона и этилакрилата. Преимуществом данного состава является то, что в процессе применения пленка растворяется в ране, постепенно высвобождая включенную в матрицу протеазу, что позволяет использовать весь содержащийся в плёнке фермент [26]. Кроме того, протосубтилин вводится в состав плёнок в виде лиофилизированного препарата процелана, являющегося дисперсной фазой описанной выше суспензии [18], что позволяет повысить стабильность протеазы в месте использования. Нетривиальный подход к созданию пленочных покрытий был использован в работе Г.А. Коваленко [17]. В ходе их разработки автором был предложен новый вид препаратов – композиционные препараты «пленка с носителем». Для их получения на поверхность полиэтиленовой пленки или гидратцеллюлозной мембраны тонким слоем наносили клей БФ-6, на котором закреплялись гранулы углерод-минеральных носителей марок СУМС-1 и СУМС-2. Полученные препараты высушивались для полного закрепления гранул, а затем погружались в раствор протосубтилина для адсорбции молекул фермента. Также автором рассматривался вариант последующей обработки композиционных препаратов с адсорбированным протосубтилином сшивающим реагентом – глутаровым альдегидом, что позволило получить более стабильные препараты.

 

Прообразом современных гелевых повязок явились так называемые мазевые повязки, представлявшие собой сетчатую текстильную основу, пропитанную гидрофильными мазями. Ранее мазевые повязки изготавливались в условиях перевязочных путем нанесения на марлю мазевой композиции с помощью шпателя. Однако в этом случае возможно недозированное, неравномерное нанесение мази на подложку при значительных затратах времени на сам процесс изготовления повязок. Кроме того, имеются сведения, что изготовление мазевых повязок в условиях перевязочных негативно сказывается на сохранении их стерильности [27].

Гелевые повязки состоят из волокнистой основы, которая, как правило, представляет собой текстильное полотно, но может быть и нетканым материалом, и нанесенного на нее геля, включающего в себя протеолитический фермент. Технология данной формы выпуска иммобилизованных протеаз состоит из следующих этапов: 1) приготовление геля (раствора полимера-гелеобразователя) и иммобилизация в нем протеолитического фермента методом включения; 2) нанесение (или импрегнирование) геля на подложку с последующим высушиванием. 

 

В качестве гелеобразователей чаще всего используются полисахариды и их производные: альгинат натрия [28, 29, 30], карбоксиметилхитозан и карбоксиметилхитин [30], аубазидан, ксантан и полимиксан [13], пектин [14]. Из синтетических полимеров используется поливиниловый спирт, сшитый тетраборатом натрия [31, 32]. Ассортимент используемых текстильных подложек также неширок и включает в себя целлюлозные (марля) и полиэфирные материалы. Сам термин «гелевые повязки», насколько нам известно, не закреплен в существующей нормативной документации, дающей определения лекарственным формам, однако он достаточно широко распространен и имеет вполне однозначное толкование в различных источниках. Однако отсутствие закрепленного определения приводит и к некоторым разночтениям. Так, в работе И.А. Кравченко и соавт. описывается получение «лечебных пластырей» с протеолитическими ферментами, технология которых, однако, полностью подпадает под описанную выше технологию гелевых повязок [14]. Следует отметить, что данный случай единичный, и нам не удалось найти других источников, использующих для обозначения данной лекарственной формы термин отличный от термина «гелевая повязка».

 

Самой обширной группой является группа волокнистых материалов. Столь широкий ассортимент объясняется использованием для получения волокон различных полимеров, а также за счет варьирования используемых для иммобилизации протеаз. В эту группу были отнесены как собственно хирургические волокна (шовный материал), так и разного рода перевязочные материалы. В подавляющем большинстве случаев для получения волокнистых материалов с протеазами используется метод ковалентной иммобилизации [17, 33, 34, 35, 36]. Поверхность волокна при этом активируется бифункциональным сшивающим реагентом, например, глутаровым альдегидом, который возможно использовать для активации и целлюлозных и полиамидных волокон. 

 

Активация целлюлозных волокон может также осуществляться обработкой окислителями с получением диальдегидцеллюлозы [33, 35]. Возможна активация поверхности целлюлозного волокна путем прививочной полимеризации акриловой кислотой [36]. Однако во всех случаях на поверхности волокна создаются активные химические группы (как правило, альдегидные), которые взаимодействуют с функциональными группами на поверхности молекулы протеазы с образованием прочных ковалентных связей, за счет чего и происходит закрепление фермента. Включение как метод иммобилизации используется значительно реже. Сам процесс включения осуществляется в момент формования волокна, он относительно прост по исполнению и не требует химической модификации полимера-носителя. Волокна, в структуру которых ферменты включаются в процессе формования, могут быть получены в значительных количествах на оборудовании, применяющемся для формования обычных волокон, причем в структуру волокна может быть введено большое количество фермента. Однако в процессе формования часто используются реагенты, инактивирующие протеолитические ферменты (например, метиленхлорид), что заставило искать пути для предотвращения или уменьшения этого эффекта. Инактивации удалось избежать, используя как технологические приемы (использование для формования прядильных растворов, являющихся суспензией фермента в растворе полимера в органическом растворителе), так и химическую модификацию самого фермента. Например, перед включением в волокна, получаемые из триацетата целлюлозы, вторичного ацетата целлюлозы или фторопласта-42, проводилась модификация протосубтилина путем присоединения его к сополимеру стирола и малеиновой кислоты в присутствии ионов Cr3+, что позволило добиться более высокой относительной активности полученных волокон и повысить устойчивость фермента к воздействию неблагоприятных факторов [37]. 

 

Говоря о получении волокнистых материалов с протеолитическими ферментами, нельзя не остановится на работе Е.В. Севастьяновой и соавт., посвященной получению углеродных тканей с иммобилизованными протеазами [38]. Авторы данной работы пошли оригинальным для разработчиков волокон с иммобилизованными протеазами путем и в качестве метода иммобилизации выбрали адсорбцию. В немалой мере этому способствовало то, что в качестве носителя были использованы не традиционные полимеры (целлюлоза и ее производные и полиамиды), а угольное волокно АУВМ «Днепр»-МН, обладающее высокими адсорбционными характеристиками. Однако проведенные исследования показали, что при адсорбции протеолитических ферментов на угольных материалах наблюдается уменьшение протеолитической активности, а в некоторых случаях изменялась и прочность угольного волокна. Поэтому с целью минимизации адгезионных взаимодействий и стабилизации ферментов были использованы полимеры, сшитые тетраборатом натрия.

Сшивка полимеров тетраборатами уже упоминалась при описании гелевых повязок, однако, вместо традиционного в таких случаях поливинилового спирта, были использованы полиэтиленоксиды ПЭО 400 и ПЭО 1500. Технология заключалась в следующем: фермент в 20% водном растворе ПЭО 400 или 5% ПЭО 1500 наносили на поверхность угольной ткани, модифицированной раствором натрия тетрабората, затем высушивали. Как видно из данного описания, предложенная технология совпадает с технологией гелевых повязок, однако в данном случае используемые полимеры не являются гелеобразующими. Нет у авторов и однозначных сведений о характере образуемой связи. Ими предполагаются два возможных механизма: 1) адсорбция угольной поверхностью мицеллярных агрегатов ПЭО со встроенными в них молекулами протеаз; 2) сшивка бурой по концевым гидроксильным группам ПЭО и гидроксильным и первичным аминным группам фермента. Не исключается и возможное участие угольной матрицы.

 

Замыкают классификацию форм выпуска иммобилизованных протеолитических ферментов мягкие лекарственные формы – мази и гели. Несмотря на то, что по количеству разновидностей ферментных препаратов эта группа находится на втором месте, уступая волокнистым материалам, ей принадлежит первенство по количеству посвященных работ.

Среди мазей с иммобилизованными протеазами преобладают мази на гидрофильных основах. Так, кремнегели, описанные в работе Г.А. Коваленко, представляли собой желатинированные золи нейтрализованного соляной кислотой силиката натрия с включенными в структуру SiO2-геля молекулами фермента. Указанные гели обладали достаточно высокой протеолитической активностью [17]. В гелях на основе активированного хитозана используется иной метод иммобилизации. Типовая технология таких гелей, изложенная в патенте Ю.М. Гафурова и соавт., состоит из нескольких последовательных стадий [39]. Предварительно приготовленный гель хитозана обрабатывают раствором глутарового альдегида. Активация полисахарида происходит за счет образования альдиминных связей между аминогруппой хитозана и одной альдегидной группой молекулы бифункционального реагента – глутарового альдегида. В полученный гель активированного хитозана вносят фермент, связывание которого происходит за счет взаимодействия свободной активной группы глутарового альдегида с аминогруппой молекулы протеазы. Таким образом были получены гели, содержащие ковалентно связанные папаин [40, 41], трипсин [42] и комплекс ферментов, выделенных из гепатопанкреаса камчатского краба [39]. Некоторые гидрофильные композиции были представлены гелями и сплавами синтетических полимеров. 

 

В качестве гелеобразователей используются, как правило, полиэтиленоксиды (полиэтиленгликоли). Например, гель полиэтиленоксида с коллазой [43, 44], гель поперечносшитого облучением ускоренными электронами полиэтиленгликоля-115 с протосубтилином (препарат «Иммозимаза») и гидрогель полиэтиленоксида с молекулярной массой 5000 и глицерина, содержащий иммобилизованный препарат протосубтилина (профезим) [19]. В последнем случае можно говорить об использовании последовательной комбинированной иммобилизации – фермент предварительно иммобилизовался на носителе, а затем носитель с иммобилизованным ферментом вносится в мазевую основу. Аналогичный метод использовался и при изготовлении мази из другого иммобилизованного препарата протосубтилина – процелана. Отличием являлось то, что в качестве матрицы для включения использовался не гидрогель, а сплав из ПЭО 400 и ПЭО 1500 [18].

Гидрофильные основы могут иметь и сложный состав. Например, для иммобилизации протеазы C использовался сплав поливинилпирролидона, глицерина, ПЭО 1500 и 1,2-пропиленгликоля [45]. Интересная композиция применялась И.Ю. Сахаровым и соавт. для включения коллагеназы краба [46]. Она включала в себя винилглутарат, винилацетат и виниловый спирт. При контакте с раневым содержимым композиция набухала и переходила в гелеобразное состояние. Используются для приготовления мазевых композиций и липофильные основы. Для получения мази с коллагеназой из Clostridium histolyticum применялась вазелиновая основа [15]. На липофильных основах приготовлены мазь «Ируксол», содержащая клостридиопептидазу A [6], мазь с протеазой C [47], мазь с морикразой [48]. Для морикразы известна также мазь на липофильной основе «Эйконол», представляющая собой комплекс эйкозапентаеновой и докозогеновой жирных кислот и витаминов A, E, D и F (мазь «Морикрол») [49]. Включение протеолитических ферментов в липофильные основы осуществляется путем суспендирования порошка нативного фермента в готовой основе.

 

Оценка частоты использования методов иммобилизации для получения раноочищающего средства с протеолитическим ферментом была произведена путем подсчета случаев использования того или иного метода в анализируемых научных публикациях. В подавляющем большинстве работ (42%) для иммобилизации протеолитических ферментов использовался метод включения. Он был представлен несколькими вариантами в зависимости от используемого носителя. Если в качестве носителя использовался гель высокомолекулярного вещества, то в этом случае иммобилизация фермента происходила за счет пространственных ограничений, накладываемых трехмерной структурой полимера. Если в качестве носителя использовалась липофильная основа, то пространственное разделение протеазы в основе-носителе достигалось механическим путем – суспендированием. Близким к данному варианту метода включения являлось получение полимерных волокон с протеолитическими ферментами из прядильных растворов с суспендированными в них ферментами. 

 

Важной особенностью включения как метода иммобилизации является то, что фермент ни к чему не прикрепляется, благодаря чему отсутствуют стерические помехи, возникающие при ковалентном или электростатическом связывании фермента с полимером [50]. Кроме того, метод отличается простотой применяемых методик, и применим для иммобилизации практически любых ферментов. Однако при использовании жестко сшитой полимерной матрицы возникают диффузионные ограничения для проникновения субстрата и если им является высокомолекулярное соединение (белок или полипептид), то этот метод неприменим вообще [51].

 

Вторым по частоте использования (использовался в 29% изученных работ) являлся метод ковалентного связывания. Основным преимуществом данного метода является высокая прочность образующегося конъюгата, обеспечивающая высокую устойчивость иммобилизованного фермента к изменению внешних условий [51]. Метод трудоемок, что объясняется сложностью подбора носителя, сшивающего (активирующего) агента и условий для проведения реакции [50]. При ковалентном присоединений фермента к носителю возможны необратимые изменения его структуры, что приводит к низкому выходу остаточной активности иммобилизуемого фермента [52]. Необходима также защита активного центра от химических модификаций [51].

 

Адсорбция применялась для иммобилизации протеолитических ферментов в 11% случаев. Этот метод является самым старым из существующих методов иммобилизации. Осуществляется адсорбция без ковалентного связывания путем простого перемешивания фермента и носителя в течение определенного времени. Однако при этом достаточно низки выход связанного фермента и остаточная активность. Кроме того, полученные таким образом препараты иммобилизованных ферментов крайне нестойки и могут десорбировать фермент при относительно небольших изменениях внешней среды [50]. Основными достоинствами метода служат простота применяемых методик и относительная доступность используемых сорбентов [51].

 

Использование в терапии раневого процесса препаратов, сочетающих в своем составе лекарственные вещества различных фармакологических групп, позволяет избежать недостатка традиционных препаратов, заключающегося в однонаправленности их действия [1]. В первую фазу раневого процесса лекарственные препараты должны подавлять инфекцию в ране, обеспечивать нормализацию местного гемостаза, активировать отторжение некротических тканей, адсорбировать отделяемое из раны [4]. Для решения первой из этих задач – подавления раневой инфекции – в состав раноочищающих препаратов вводятся вещества, обладающие противомикробной активностью. При этом в комбинации с иммобилизованными протеазами используются как индивидуальные противомикробные вещества, так и их сочетания. 

 

В ряде работ в качестве противомикробного компонента используются вещества природного происхождения – литические ферменты (лизоцим) и их комплексы [28, 29, 32, 38]. Однако целесообразность такого сочетания вызывает сомнение, так как хотя литические ферменты и дополняют спектр некролитического действия иммобилизованных протеаз, по своей природе они являются белками, то есть субстратом для протеолитических ферментов. Использование синтетических противомикробных веществ также сопряжено с рядом трудностей. Так, согласно сведениям Л.А. Блатуна, к гентамицину нечувствительны от 80 до 100% выделяемых при гнойном осложнении ран штаммов микроорганизмов. Фурацилин также практически полностью утратил свою антимикробную активность по отношению к основным возбудителям хирургической инфекции [1]. 

 

Результаты исследований, проведенных С.Н. Мурашко с соавт. с целью выявления эффективных химиотерапевтических синтетических препаратов (антибиотиков и антисептиков), активных в отношении основных представителей микрофлоры ран, показали, что наиболее эффективными в отношении изученных штаммов микроорганизмов были хлоргексидин и диоксидин. Использование полусинтетических антибиотиков из групп пенициллинов, цефалоспоринов и аминогликозидов на обширных раневых поверхностях признано авторами нецелесообразным [53]. Следует обратить внимание и на хлорамфеникол (левомицетин) – антибиотик широкого спектра действия, входящий в состав мази «Ируксол» и таких лекарственных препаратов как мази «Левомеколь» и «Левосин», применяемых для лечения гнойных ран в первой фазе раневого процесса. Однако он слабоактивен в отношении кислотоустойчивых бактерий, синегнойной палочки и клостридий [9].

 

Главным преимуществом мягких лекарственных форм иммобилизованных протеаз является сочетание в них нескольких факторов, повышающих эффективность и удобство применения. Во-первых, мягкие лекарственные формы могут быть нанесены на раны любого рельефа, при этом обеспечивается полный контакт с раневой поверхностью. Во-вторых, количество используемой мягкой лекарственной формы, а вместе с ним и выраженность некролитического действия, может легко регулироваться в зависимости от текущей терапевтической потребности и не зависит от использования прочих средств, например, перевязочных материалов. В-третьих, использование гиперосмолярных основ позволяет оказывать дегидратирующее действие. При этом происходит отток из прилежащих ране тканей продуктов некроза и токсинов. Поглощение идет всем объемом основы и далее по осмотическому градиенту – в повязку. В-четвертых, использование в качестве матрицы гидрофильной основы позволяет использовать «мягкий» и наиболее эффективный метод иммобилизации – включение. При этом в процессе поглощения матрицей-основой раневого отделяемого и изменения ее консистенции происходит «раскрытие» внутренней структуры с постепенным высвобождением всего иммобилизованного фермента. Кроме того, технология производства мягких лекарственных форм позволяет относительно легко вводить в них дополнительные действующие вещества или их сочетания. Однако описанные преимущества характерны не для всех мягких лекарственных форм, например, гели из поперечносшитых полимеров представляют собой подобие пленок с присущими этой лекарственной форме недостатками.

 

Таким образом, проанализированные нами литературные сведения в отношении указанных характеристик используемых лекарственных форм позволяют заключить, что предпочтительными для иммобилизованных протеолитических ферментов являются мягкие лекарственные формы (мази и гели), основанные на гидрофильных гиперосмолярных основах, в которых нет жестких (ковалентных) связей между молекулами компонентов основы и фермента.

 

Литература:

 

1. Блатун, Л.А. Фармацевтический вестник, 2002, С.18.

2. Гурьева И.В. Русский медицинский журнал, 2002, Т.10, №11, С. 509-513.

3. Гостищев В.К. [и др.] Местное лечение ран: материалы Всесоюз. конф., М., 1991, С. 67-68.

4. Алексеева И.В. Фармация, 2003, №2, С. 43-45.

5. Макарьин В.Е., Турсунов Б.С. Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов. М., 1992, С. 115-116.

6. Федеральное руководство по использованию лекарственных средств (формулярная система). Выпуск XI.. М.: «ЭХО», 2010, 944 с.

7. Деримедведь Л.В. [и др.]. Провизор, 2002, №1, С. 20-22.

8. Cooney D.A., Stergis G., Jayaram H.N. Enzymes Therapeutic in Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd ed., vol. 9., pp. 225-240.

9. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т., 13-е изд., новое. Харьков: Торсинг, 1998, Т.2, 592 с.

10. Люджус Л.Л. [и др.]. Получение и применение ферментов, витаминов, аминокислот, премиксов: обзор информ, М., 1986.

11. Яремчук А.Я., Мендель А.К., Карабан Н.И. Клин. медицина, 1982, Т.60, №6, С. 100-103.

12. Перцев И.М., Даценко Б.М., Гунько В.Г. Фармация, 1990, Т.39, №5, С. 73-77.

13. Давиденко Т.И. Хим.-фармац. журн., 1999., Т.33, № 9, С. 27-29.

14. Кравченко И.А., Давиденко Т.И. Фармаком, 1993, №10-11, С.46-52.

15. Дихтярев С.И, Маслова Н.Ф. В кн.: Технология и стандартизация лекарств: сб. науч. тр., Т.2. – Харьков: ИГ «РИРЕГ», 2000, 784 с.

16. Толстых П.И. [и др.]. Хирургия, 1985, №9, С.129-136.

17. Коваленко Г.А. Хим.-фармац. журн., 1998, Т.32, №4, С. 41-44.

18. Пуоджюнене Г. [и др.]. Хим.-фармац. журн., 2003, Т.37, № 10, С. 23-26.

19. Пат. 2150936 РФ, МПК A61K9/06, A61K38/48, A61P17/02, №97120950/14.

20. Самойлова Л.Н. [и др.]. Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ: тез. докл. Всесоюз. конф. 27-28 нояб. 1990 г., М., 1990, С. 125.

21. US Patent 4613502, I.C. A61K 037/48; A61K 037/547, № 679118.

22. Zhuang P., Butterfield D.A.. Biotechnol. Progr., 1992, vol. 8, №3, pp. 204-210.

23. US Patent 6074664, I.C. A61L 015/38, №875723.

24. Кильдеева Н.Р. [и др.]. Биохимия, 1980, Т.45, №3, С. 569-574.

25. Макаров К.А., Терещенко Г.П., Башкович А.П. Применение новых биополимерных материалов в медицине. Л., 1979.

26. Пуоджюнене Г. [и др.]. Хим.-фармац. журн., 2005, Т.39, №1, С. 34-36.

27. Адамян А.А., Добыш С.В. Новая аптека. Аптечный ассортимент, 2005, №9, С. 37-39.

28. Юданова Т.Н. [и др.]. Хим. технология, 2000, №7, С. 38-41.

29. Юданова Т.Н. [и др.]. Антибиотики и химиотерапия, 2003, Т.48, № 4, С. 7-10.

30. Скокова И.Ф. [и др.]. Текстильная химия, 1998, Т.13, №1, С. 96-102.

31. Давиденко Т.И. [и др.]. Фармаком, 1993, №12, С. 5-11.

32. Чуенко А.В. [и др.]. Химия природ. соединений, 1990, №4, С. 528-532.

33. Белов А.А., Игнатюк Т.Е. , Рыльцев В.В. Хим.-фармац. журн., 1992, Т.26, №11/12, С. 101-103.

34. Аминовская В.А. [и др.]. Человек и лекарство: тез. докл. 12 Рос. нац. конгр. 18-22 апр. 2005 г. М., 2005, С. 632.

35. Толстых П.И. [и др.]. Фарматека, 2004, № 16, С. 12-16.

36. Юданова Т.Н., Скокова Н.Ф., Вирник А.Д. Изв. вузов. Химия и хим. технология, 1992, Т.35, вып. 9, С. 95-99.

37. Вирник А.Д. [и др.]. Антибиотики и мед. биотехнология, 1986, Т.31, №2, С. 117-122.

38. Севастьянова Е.В. [и др.]. Хим.-фармац. журн., 1992, Т.26, №6, С. 40-42.

39. Пат. 1814764 РФ, МПК A61K31/557, A61K47/48, №4848928/14.

40. Shui De-xin [et al.]. Chim. J. Chin. Univ., 1991, vol. 12, №3, pp. 423-425.

41. Jiang Yong-ming [et al.]. Chin. Bichem. J., 1993, vol. 9, №4, pp. 470-474.

42. Shui De-xin, Chen Tian, Jiang Yong-ming. Chin. Biochem. J., 1991, vol. 7, №5, pp. 555-559.

43. Маркович Н.А. [и др.]. Бюл. экспер. биол. и медицины, 1996, Т.122, № 7, С. 97-100.

44. Островидова Г.У., Макеев А.В. Российский журн. приклад. химии, 2002, Т.75, №9, С. 1477-1480.

45. Пат. 2076697 РФ, МПК А61К9/06, А61К38/43, А61К47:30, А61К47:10, А61К31:71, №93000551/14.

46. Пат. 2014086 РФ, МПК A61L15/12, №5002616/14.

47. Синицына Н.И. [и др.]. Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ: тез. докл. Всесоюз. конф. 27-28 нояб. 1990 г. М., 1990, С. 126-127.

48. Пат. 2149644 РФ, МПК A61K38/48, №97120399/14.

49. Руденская Г.Н. [и др.]. Вестн. моск. ун-та. Сер. 2. Химия, 2000, Т.41, №6, С. 414-416.

50. Тривен М. Иммобилизованные ферменты: пер. с англ. М.: Мир, 1983, 213 с.

51. Березин И.В. [и др.]. Биотехнология: учеб. пособие для вузов. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты. М.: Высш. шк., 1987, 159 с.

52. Муронец В.И., Наградова Н.К. Иммобилизованные олигомерные ферменты. М.: Наука, 1984, 208 с.

53. Мурашко С.Н., Мороз А.Ф., Бродинова Н.С. Антибиотики и мед. биотехнология, 1986, №5, С. 381-385.

 

 

Библиографическая ссылка:

 

В. В. Верниковский, Э. Ф. Степанова. Иммобилизованные протеазы для очищения раневых поверхностей. // Российский химический журнал. 2010. Том LIV. №6. С. 94-100.